別添

細胞量を決定する必要がある。一方接着細胞であれば、培養上清を被験物とすること
によりかなりの量の検体から汚染微生物由来のゲノムを抽出可能である。また、回収
した培養上清の遠心操作等により菌を濃縮することもでき、より高感度な解析が可能
となる。
⑥

自動核酸抽出装置を用いる場合の留意点
被験物からの汚染微生物由来のゲノムの抽出操作法としては、キット化された核酸

抽出法が用いられることも多い。あるいはキットと自動核酸抽出装置の組合せにより、
サンプリングした被験検体を装置にセットするだけで、抽出操作が完了できるものも
ある。ただし、このような自動化装置では、最終的に得られる核酸抽出液量が機器の
設定上相当量のボリュームを持っているために、抽出液の一部しか核酸増幅反応に用
いることができないこともあり、このような抽出機器の設計のために目的検出感度の
制限が生じることがある。
⑦

被験用量と目的検出感度の関係
最終産物である特定細胞加工物等によっては量的に制限があるが、迅速無菌試験に

供する被験用量によって目的検出感度が異なる。目的とする被験物から非常に少ない
被験検体を採取する場合には偽陰性を生じるリスクがある（別添１図２）。適切な被
験用量を採取して試験を実施することが重要である。
⑧

Direct「NAT の留意点
核酸（ゲノム）を抽出後に NAT を実施するのではなく、被験検体に含まれる汚染微

生物を特殊な検体溶解液で可溶化し、その可溶化された溶解液中のゲノムの一定量を
直接反応液に添加し、NAT により増幅する方法（例えば Direct「 PCR）も開発されてい
る。ただ、ゲノムを溶出させるための溶解液に含まれる菌体を溶解させる成分（溶解
剤）が NAT 反応を阻害することが知られており、NAT 反応を行う際にはこのような溶
解剤の影響を避けるために希釈を行った上で増幅反応を実施する必要がある。したが
って、その希釈操作による感度の低下を含め、どれほどの目的検出感度が得られるか
について、被験物に標準菌などを播種して確認しておくことが必要である。
⑨

等温増幅法（LAMP 法等）の留意点
増幅反応としてはアニーリングとポリメラーゼ反応の温度サイクルを繰り返す PCR

反応ばかりでなく、LAMP 法や SmartAmp 法等の等温増幅反応も知られている。いずれ
の NAT 反応においてもターゲットとする目的ゲノム配列を増幅するためのプライマー
セットの選択が非常に重要となる。例えば一対のプライマーセットだけではなく、よ
り広範な微生物を検出するために複数のプライマーセットを用いることも多い。市販
キットを用いる場合にも、プライマーセットが検出可能な微生物を考慮して選択する
必要がある。
⑩

カットオフ値の設定
増幅反応での考慮事項として、例えば PCR 反応では増幅サイクル数が多くなるほど

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